منبع پایان نامه ارشد درباره پلي، گيرنده، بيماري، کيستيک

دسامبر 29, 2018 0 By mitra1--javid

مي باشد، رخ داده است و موجب تبديل سيتوزين به تيمين مي گردد. در نتيجه اين تغيير نوکلئوتيدي، اسيد آمينه کدون 164 که ترئونين مي باشد، تبديل به ايزولوسين مي شود ]52 و 54[.
کدون 164 در چهارمين دومن گذرنده از غشاء (Transmembrane) گيرنده بتا-2 آدرنرژيک قرار دارد. پلي مورفيسم اين کدون (ADRB2rs1800888(Thr164Ile)) باعث کاهش اتصال G-پروتئين تحريکي به گيرنده مي شود، که در نتيجه فعاليت گيرنده کاهش مي يابد. به عبارتي تغيير در کدون 164، موجب کاهش عملکرد يا فقدان عملکرد (loss of the function) گيرنده بتا-2 آدرنرژيک مي گردد. نتايج حاصل از اين تغيير مي تواند موجب کاهش تمايل اتصال گيرنده به کاتکول آمين شده و همچنين مي تواند باعث کاهش فعاليت آدنيليل سيکلاز نيز گردد که در نتيجه اين ها، اتصال گيرنده به G- پروتئين کاهش مي يابد ]38[. اطلاعات کامل کدون 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک در بخش ضمائم در صفحه قرارداده شده است.

1-8- فرضيه هاي تحقيق
1- ژن 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک در روند بيماري زايي سندرم تخمدان پلي کيستيک نقش عمده اي را ايفا مي نمايد.
2- ژن 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک در روند بيماري زايي سندرم تخمدان پلي کيستيک دچار عدم فعاليت مي گردد.
3- موتاسيون ژن 164 گيرنده بتا2 آدرنرژيک مي تواند همراه (association) بيماري باشد.

1-9- پرسش اصلي تحقيق
آيا پلي مورفيک بودن ژن 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک در ايجاد بيماري تخمدان پلي کيستيک نقش مؤثر دارد؟

1-10- هدف اصلي تحقيق
مطالعه و بررسي فراواني پلي مورفيسم ژن 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک در بيماران مبتلا به سندرم تخمدان پلي کيستيک مراجعه کننده به درمانگاه نازايي ولي عصر(عج) بيمارستان اما خميني.

فصل دوم
مروري برمتون گذشته
2-1- تاريخچه سندرم تخمدان پلي کيستيک
براي اولين بار در سال 1844، Chereau و همکارانش تغييراتي مبني بر اين بيماري در تخمدان انسان را شرح دادند ]11[. در سال 1935، دو نفر به نام هاي Irving Stein و Michael Leventhal که در گروه “زنان و مامايي، بيمارستان Michael Reese، شيکاگو، ايالات متحده آمريکا” کار مي کردند، براي اولين خصوصيات باليني و ويژگي هاي بافتي سندرم تخمدان پلي کيستيک را ارائه نمودند. آن ها ارتباطي بين آمنوره (فقدان قاعدگي)، هيرسوتيسم (پرمويي) و PCOS مشاهده کرده بودند ]44[.
از آن پس به طور مرتب گزارش هايي از اين اختلال داده شد. تا اين که در گردهمايي در سال 2003 روتردام، متخصصان PCOS از تمام نقاط جهان گرد هم آمدند و يک معيار تشخيصي جهاني براي PCOS در نظر گرفتند. معيار تشخيص اين بيماري براساس حضور دو مورد از سه مورد ذيل مي باشد:
1- افزايش آندروژن بيوشيميايي يا کلينيکي
2- قاعدگي نامنظم يا عدم تخمک گذاري
3- وجود تخمدان هاي پلي کيستيک ]46[.

2-2- پيشينه و سوابق تحقيق
سندرم تخمدان پلي کيستيک با درجه شيوع 5 تا10 درصدي، يک اختلال اندوکرين- متابوليکي است که شايع ترين علت ناباروري با عدم تخمک گذاري و هايپرآندروژنيسم در زنان مي باشد. عدم تخمک گذاري تقريباً عامل 40% نازايي زنان است. بسياري از اين زنان مبتلا به سندرم تخمدان پلي کيستيک مي باشند. با توجه به تحقيقات گسترده اي که در دنيا روي اين بيماري صورت مي گيرد هنوز اتيولوژي آن ناشناخته و علت آن همان پيچيدگي پاتوفيزيولوژي با اختلال عملکرد اندوکرين- متابوليک در محور هيپوتالاموس- هيپوفيز- آدرنال مي باشد ]40[.

امروزه مشخص شده است که عملکرد تخمدان توسط پيام يا سيگنال هاي هورموني خارج و داخل تخمداني مي تواند به طور همزمان رشد فوليکولي، ترشح استروئيد و روند تخمک گذاري را کنترل کند. يافته هاي چند سال اخير نشان مي دهد که، سيستم سمپاتيک تخمداني در رشد فوليکول و روند توليد هورمون هاي استروئيدي تخمدان کاملاً مؤثر است. سابقه علمي بيماري تخمدان پلي کيستيک نشان مي دهد که بيشترين گزارشات در مورد خطر يا وقوع بيماري هاي بعد از ابتلاء به تخمدان پلي کيستيک از جمله: ديابت مليتوس، بيماري هاي قلبي و عروقي (خطر افزايش فشار خون و سکته قلبي(، اختلال در الگوي ليپيدي سرم، سرطان آندومتر، پستان و تخمدان و آپنه يا وقفه تنفسي در حين خواب مي باشد ]7[.
همچنين در سال هاي اخير برخي تحقيقات از نظر ژنتيک به بيماري تخمدان پلي کيستيک پرداخته و تاکنون چندين ژن از جمله ژن هاي بيوسنتز و متابوليسم استروژن، ژن هاي چاقي، تنظيم انرژي، ترشح و عملکرد انسولين، آزمايش و مورد بررسي قرار گرفته اند ]31[ .
همچنين مشاهدات باليني به طور قوي از منشأ جنيني سندرم تخمدان پلي کيستيک و اينکه آندروژن بالا در دوران جنيني مي تواند عامل اجرايي قوي اي جهت فنوتيپ PCOS در دوران بزرگسالي زنان شود، هر چند که ميزان آندروژن بعد از تولد در نوزاد طبيعي باشد، انجام پذيرفته است. به هرحال بالا بودن آندروژن در مادر و جنين هر دو مي تواند مکانيسم هاي قابل درکي را در زمينه سازي ژنتيک بيماري فراهم نمايد. نتايج مطالعات اخير نشان مي دهد که فاکتورهاي ژني در بروز اين بيماري نقش مهمي دارد ]53[.
امروزه فعاليت بالاي سمپاتيکي نزد بيماران پلي کيستيک تخمدان محرز بوده و همچنين تحقيقات نشان داده است که توارث در اين بيماري نقش دارد. اين بيماري چون ناهمگن و چند منشوري است، نمي توان آناليز طيف فنوتيپ ها را از ديد پاتوژنتيک تفسير نمود. ولي با اين وجود گزارشات نشان مي دهد که ژنتيک و عوامل محيطي، هر دو در اين بيماري نقش دارند.
تاکنون تحقيقات بسياري روي گيرنده بتا-2 آدرنرژيک و همچنين بيماري سندرم تخمدان پلي کيستيک انجام پذيرفته است،
اما هيچ تحقيق و نتايجي در ارتباط با کدون 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک و بيماري سندرم تخمدان پلي کيستيک گزارش نگرديده است. اگرچه، همان طور که در بالا اشاره شد ارتباط کدون 164 گيرنده مذکور با برخي بيماري ها بررسي و ارائه گرديده است که به برخي از آن ها اشاره خواهد شد.
از طرفي ارتباط گيرنده بتا-2 با ساير بيماري ها، و تأثيرات ساير ژن ها نيز با بيماري سندرم تخمدان پلي کسيتيک گزارش شده است که گزارشات نتايج آن ها در دسترس مي باشد. در مواردي نيز ارتباط ساير کدون هاي گيرنده بتا-2 با بيماري PCOS مورد بررسي قرار گرفته و مواردي مبني بر ارتباط معني دار بين آن ها گزارش گرديده است که نتايج اين تحقيقات نيز در اين بخش گردآوري شده است.
در سال 2001، Johan Hoffstedt و همکارانش در سوئد، با بررسي روي 236 نفر ارتباط معني داري بين پلي مورفيسم کدون 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک و عملکرد گيرنده adipocyte (گيرنده تجزيه چربي) ارائه نمودند. بدين صورت که با ايجاد پلي مورفيسم در کدون مذکور و تبديل اسيدآمينه ترئونين به اسيدآمينه ايزولوسين، عملکرد گيرنده فوق در سلول هاي چربي که حامل اثر اين جهش يعني حامل اسيدآمينه ايزولوسين هستند، کاهش مي يابد ]30[.
در سال 2002، Macho Azcarate و همکارانش در اسپانيا بررسي تأثير پلي مورفيسم گيرنده بتا-2 آدرنرژيک و متابوليسم چربي را در گروهي از زنان چاق در اسپانيا به انجام رساندند. در اين مطالعه، 8نفر بيمار چاق و 7 نفر شاهد مورد بررسي قرار گرفتند و مشاهده گرديد که کدون 27 گيرنده بتا-2 در اين زنان چاق دچار جهش از نوع هموزيگوت و پلي مورفيسم مي باشند. در واقع کدون 27 اين گيرنده که اسيد آمينه گلوتامين را رمز مي نمايد، در اثر SNP مبدل به اسيدآمينه گلوتامات مي شود. در نتيجه متابوليسم و اکسيداسيون چربي ها دچار اختلال گرديده و فرد با افزايش بي رويه وزن روبرو خواهد بود ]17[.
در سال 2006، Kurabayashi و همکارانش در مطالعه اي روي 59 نفر از زنان ژاپني که دچار سندرم تخمدان پلي کيستيک بودند و 97 نفر از زنان به عنوان گروه شاهد، ارتباط گيرنده بتا-2 آدرنرژيک با سندرم تخمدان پلي کيستيک را مورد بررسي قرار دادند. در اين پژوهش ارتباط معني داري بين بيماري PCOS و پلي مورفيسيم کدون 27 گيرنده مذکور به صورت هتروزيگوت مشاهده گرديد. همان طور که گفته شد پلي مورفيسم کدون 27 موجب توليد اسيدآمينه گلوتامات به جاي اسيدآمينه گلوتامين مي گردد ]33[.
در سال 2007، Emanuele Barbato و همکارانش، در بلژيک با بررسي روي 55 نفر از بيماراني با نقص قلبي مادرزادي، نشان دادند که در اين بيماران کدون 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک دچار پلي مورفيسم گرديده است. در نتيجه با جايگزيني اسيدآمينه ايزولوسين به جاي اسيدآمينه ترئونين در پروتئين گيرنده مذکور، بيماران دچار نقص در عملکرد انقباضي ميوکارد قلب مي گردد ]19[.
در سال 2009، Lee و همکارانش در مطالعه اي روي دانش آموزان تايواني، ارتباط معني داري را بين کدون 27 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک و بيماري تنفسي خس خس سينه نشان دادند ]34[.
در سال 2012، Thomsen و همکارانش در دانمارک با مطالعه بر روي کدون 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک، ارتباط معني داري بين اين کدون و ديابت نوع دوم و همچنين چاقي مشاهده نمودند ]48[.
طبق ضوابط رتردام در سال 2003 سه شاخصه اصلي براي تخمدان پلي کيستيک وجود دارد که شامل: حضور و وجود کيست در تخمدان (تست سونوگرافي)، سيکل نامنظم و بهم خوردن تعادل بين دو هورمون گنادوتروپين FSH / LH (تست بيوشيميايي) مي باشد، از اينرو Nana Liu و همکارانش در سال 2012 ، ارتباط پلي مرفيسم ژن G1052A هورمون LH و همچنين ژن ديگري در گيرنده هورمون LH (LHR) را با سندرم تخمدان پلي کيستيک، مورد مطالعه و بررسي قرار دادند، نتايج تحقيقات ايشان نشان مي دهد که، موتاسيون ژن LH G1052A مي تواند در استعداد و فنوتيپ هاي تخمدان پلي کيستيک موثر باشد ]36[.
در سال 2013، Tellechea و همکارانش در آرژانتين، ارتباط هاپلوتيپ هاي ADRβ2 و مقاومت به انسولين را در 100 نفر بيمار مبتلا به PCOS مورد بررسي قرار دادند. در اين پژوهش بيماران با PCOS داراي هاپلوتيپ CCGG در گيرنده بتا-2 در مقايسه با 65 نفر گروه شاهد بودند. در نتيجه دچار اختلال سندرم متابوليک و مقاومت به انسولين گرديده بودند ]47[.
گزارشات مربوط به اين کدون در بيماري هاي قلبي و عروقي نيز رديابي شده است. ولي در مورد تخمدان پلي کيستک و کدون 164 گيرنده مذکور، هنوز گزارشي در دست نمي باشد.
هدف ما از انجام اين تحقيق، بررسي تاثير پلي مورفيسم کدون 164 گيرنده بتا-2 آدرنرژيک در بيماران مبتلا به تخمدان پلي کيستيک در زنان ايراني است، که تا کنون گزارشي از آن منتشر نشده است. با توجه به پرسشگري هاي صورت گرفته و درج آن در مقالات داخل و خارج و همان طور که در بخش هاي قبل هم ذکر شد، مشخص شده است که اکثريت بيماران مبتلا به سندرم تخمدان پلي کيستيک، مادر و يا خواهر مبتلا داشته اند.
با توجه به اين نکته مهم که سندرم تخمدان پلي کيستيک در انسان و مدل حيواني با افزايش فعاليت سيستم سمپاتيکي همراه است و با توجه به اين که بيان ژن گيرنده هاي بتا-2 در تخمدان صورت گرفته است، برآن هستيم که بررسي تأثير پلي مورفيسم ژن گيرنده مذکور را در نمونه خون بيماران مبتلا به PCOS بررسي نماييم. با اين هدف که راهي از طريق فارماکوژنوميکس (به ‌کارگيري تکنيک‌هاي پروتئوميکس در يافتن‌ هدف داروها) در سندرم يا بيماري تخمدان پلي کيستيک که خود مهم ترين و بيشترين عامل ناباروري نزد زنان جوان ايراني مي باشد، به وجود آوريم.

فصل سوم
مواد و روش ها
>

3-1- دستگاه هاي مورد استفاده
يخچال و فريزر 20- درجه سانتي گراد.
دستگاه بن ماري (حمام آب).
دستگاه سانتريفوژ مدل Universal 320R.
دستگاه پالس ورتکس (Pulse vortex) مدلKIA GENE,KIA82119 .
دستگاه PCR مدلPCR PalmCycler CORBETT.
دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل Nanodrop2000.
ترازوي 0.01 مدل KERN.
دستگاه مايکروويو.
دستگاه شيکرHORIZONTAL.SHAKER.HS230 .
تانک الکتروفورز مدل افقي و منبع تغذيه.
دستگاه UV Trans luminator مدل UV,BTS-20-M.

3-2- مواد و لوازم مصرفي
سمپلرهاي 10-1، 100-10 و 1000-100 ميکرو ليتر SOCOREX.
سر سمپلر زرد و آبي.
لوله هاي مخروطي ميکرو تيوپ ml 2/0 و 5/0 .
ارلن ، بشر ، مزور(استوانه مدرج).
کيت استخراج DNA شرکت “سيناژن” حاوي انواع بافر و پروتئاز و حلال پروتئاز.
مستر ميکس شرکت بيوتک پيشگام Taq DNA Polymerase 2x Master Mix Red.

بافر TAE (Tris Acetate ETDA) 1x.
پودر آگاروز 5/1 %.
شناسگر اندازه DNA (Gen Ruller 100b.p Ladder) شرکت بيوتک پيشگام.
نمونه کنترل منفي حاوي پرايمرهاي FORWARD , REVERSE ، آب 2 بار تقطير و Master Mix .
آب 2 بار تقطير ( H2O ).
اتانول 100 و 96 درصد ( C2H5OH ).
سفارش و ساخت پرايمر فوروارد و معکوس توسط شرکت دانا ژن پژوه.

3-3- روش ها و تکنيک ها

3-3-1- نمونه برداري
در اين پژوهش، از 27 نفر زن در درمانگاه نازايي ولي عصر(عج) بيمارستان امام خميني(ره) شهر تهران نمونه خون محيطي جمع آوري گرديد. از بين افراد مراجعه کننده به درمانگاه ذکر شده تعداد 14 نفر بيمار مبتلا به سندرم تخمدان پلي کيستيک انتخاب شدند و همچنين تعداد 13 نفر افراد سالم به عنوان گروه شاهد انتخاب گرديد.
لازم به ذکر است که در بيماران انتخاب شده مبتلا به سندرم تخمدان پلي کيستيک، تشخيص اوليه بر مبناي شرح حال، معاينات باليني، آزمايشات لازم، سونوگرافي و رد ساير بيماري ها نظير نئوپلاسم، هيپرپلازي مادرزادي آدرنال بود که توسط پزشك متخصص درمانگاه ولي عصر(عج) قبلاً صورت گرفته و درمان دارويي هنوز آغاز نگرديده بود.
گروه شاهد را افرادي تشکيل دادند که در خارج از بيمارستان امام خميني (ره) بودند و از طريق پرسشگري هاي انجام پذيرفته شده به درمانگاه مذکور فراخوانده و نمونه خون محيطي از ايشان گرفته شد. اين گروه از زنان سابقه سندرم تخمدان پلي كيستيك را در خود و خانواده هايشان نداشتند و تشخيص همانند گروه بيمار بر اساس شرح حال، معاينات باليني، آزمايشات لازم، سونوگرافي مي باشد.
در نهايت از هر نفر 5 ميلي ليتر خون وريدي دريافت و در لوله آزمايش ريخته شد. نمونه هاي خون براي جلوگيري از منعقد شدن با بافر EDTA مخلوط گرديد و تا زمان شروع استخراج در دماي 20- درجه سانتي گراد نگهداري شدند.

3-3-2- استخراج DNA ژنوميک
استخراج DNA، اولين و مهم ترين نياز در اجراي تحليل هاي ژنتيكي، مانند تشخيص جهش و پي بردن به توالي و عملكرد بخش ويژه اي از ژنوم است. موفقيت هاي ناشي از استخراج مناسب DNA به خلوص عالي و غلظت بالاي DNA استخراج شده وابسته است. معمولاً كيفيت DNA با عواملي مانند عدم آلودگي ناشي از RNA، پروتئين، ليپيد و ساير ساختارهايي كه براي آنزيم Taq پليمراز (Taq