پرايمر، توالي، سانتي، دماي

پرايمر، توالي، سانتي، دماي

دی ۸, ۱۳۹۷ 0 By mitra1--javid

لوله آزمايش ريخته شد. نمونه هاي خون براي جلوگيري از منعقد شدن با بافر EDTA مخلوط گرديد و تا زمان شروع استخراج در دماي ۲۰- درجه سانتي گراد نگهداري شدند.

۳-۳-۲- استخراج DNA ژنوميک
استخراج DNA، اولين و مهم ترين نياز در اجراي تحليل هاي ژنتيكي، مانند تشخيص جهش و پي بردن به توالي و عملكرد بخش ويژه اي از ژنوم است. موفقيت هاي ناشي از استخراج مناسب DNA به خلوص عالي و غلظت بالاي DNA استخراج شده وابسته است. معمولاً كيفيت DNA با عواملي مانند عدم آلودگي ناشي از RNA، پروتئين، ليپيد و ساير ساختارهايي كه براي آنزيم Taq پليمراز (Taq DNA Polymerase ) در واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR) و آنزيم هاي برشي مزاحم، سنجيده مي شوند] ۶[.
مولکول هايDNA در مقايسه با توالي هاي پروتئيني، بسيار بزرگتر و پيچيده تر مي باشند. هر يک از مولکول هاي DNA هسته اي اغلب حاوي صدها ميليون نوکلئوتيد هستند. وقتي DNA با استفاده از روش هاي استاندارد از سلول ها جدا سازي مي شود، مولکول هاي عظيم آن بر اثر نيروهاي برشي قطعه قطعه و مخلوط هاي پيچيده اي از قطعات DNA بسيار بزرگ (به طول ۵۰ تا ۱۰۰کيلو باز) را ايجاد مي کنند، که در اين حالت چالش مورد مواجهه نحوه آناليز آن است. در نتيجه با استفاده از روش اولترا سانتريفيوژ در گراديان هاي چگالي تعادلي، معمولاً DNA به دست آمده از يک سلول به صورت يک نوار اصلي که نمايانگر توده DNA است، تفکيک مي شود ]۱٫[
در اين پژوهش استخراج DNA ژنوميک از طريق کيت استخراج DNA سيناژن (CinnaGen) ايران ، انجام پذيرفت.
۳-۳-۲-۱- استخراج DNA با استفاده از کيت شرکت سيناژن
مبناي کار استخراج DNA دو مرحله کلي دارد: ۱- آزاد سازي DNA مورد بررسي از داخل سلول و ليز کردن آن توسط بافر ليز کننده. ۲- حذف مواد آلي و تغليظ DNA توسط بافرهاي موجود در کيت. اما تفاوت هاي کوچکي در به کارگيري مواد و مقدار آن ها در مقايسه با کيت سينا ژن وجود دارد. با استفاده از اين روش، DNA طبق دستورالعمل شرکت سازنده کيت استخراج گرديد. اطلاعات مربوط به کيت مذکور در جدول ۳-۱ به اندازه ي يک نمونه ليست شده است.

جدول ۳-۱- مواد لازم براي استخراج DNA توسط کيت سيناژن براي ۱نمونه
مقدار موجود
نوع ماده
۴۰۰ µl
محلول ليز يا هضم کننده (Lysis Buffer)
300 µl
محلول رسوب دهنده (Precipitation Buffer)
400 µl
بافر شستشو ۱ (Wash Buffer I)
800 µl
بافر شستشو ۲ (Wash Buffer II)
30µl
بافر شوينده و پاک کننده (Elution Buffer)

در اين روش، مقدار ۱۰۰ ميکروليتر از نمونه خون بيمار را به ميکروتيوپ ها منتقل کرده و با ۴۰۰ ميکروليتر از محلول بافر Lysis مخلوط و سپس به مدت ۲۰ ثانيه با بالاترين سرعت vortex مي شود، تا يک سوسپانسيون يکنواختي ايجاد گردد، پس از آن ۳۰۰ ميکروليتر از بافر رسوب دهنده (Precipitation) را به محلول اضافه و مجددا به مدت ۵ ثانيه با سرعت vortex نموده مي شود.
در اين مرحله، سلول هاي گلبول هاي خوني متلاشي شده و محلولي از تمام مواد آلي و معدني گلبول هاي سفيد و قرمز به دست مي آيد. سديم دودسيل سولفات (SDS) موجود در بافر ليز کننده، باعث حل شدن ليپيدها شده و پروتئيناز K آن باعث شکستن پروتئين ها و هيستون ها مي گردد. مجموعه عوامل فوق باعث پاره شدن غشا سلول و هسته گرديده و رشته هاي نهايي DNA آزاد مي شوند.
محلول فوق را با سمپلر به ميکروتيوپ جديدي که همراه با تيوپ مخصوص (Collction Tubes) موجود در کيت مي باشد منتقل کرده و در ۱۳۰۰۰ دور در دقيقه (rpm) به مدت ۱ دقيقه سانتريفيوژ مي گردد و سپس Collction Tube که حاوي رسوب موادي غير از DNA مي باشد دور انداخته مي شود و ميکروتيوپ حاوي محلول به Collction Tube جديدي انتقال داده مي شود.
در اين مرحله ۴۰۰ ميکروليتر بافر شستشو شماره ۱ را اضافه نموده و باrpm 13000 به مدت ۱دقيقه سانتريفيوژ کرده و مجدداً رسوبات غير از DNA دور ريخته مي شود، اين کار با بافر شستشوي شماره ۲ ، دو مرتبه تکرار مي گردد و در آخر پس از انتقال محلول حاوي DNA به Collction Tube جديد، ۳۰ ميکروليتر بافر Elution را اضافه و در دماي ۶۵ درجه سانتي گراد به مدت ۳ تا ۵ دقيقه در بن ماري انکوبه مي گردد و سپس مجدداً محلول درrpm 13000 به مدت ۱ دقيقه سانتريفيوژ مي شود تا در نهايتDNA به صورت نوار يا توده سفيد رنگي بدست آيد. سپس نمونه هاي DNA براي نگهداري در مدت زمان طولاني تر به فريزر با دماي ۲۰- درجه سانتي گراد منتقل مي شود.

۳-۳-۳- بررسي کميت و کيفيت DNA استخراج شده
براي انجام يک PCR موفق، بايد DNA استخراج شده خالص و به مقدار و غلظت معين باشد. در بررسي کيفيت DNA نيازمند ۳ طول موج مختلف ۲۳۰ ، ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر مي باشيم. براي بررسي حضور پپتيد و عوامل ديگر از نسبت طول موج هاي ۲۶۰ و ۲۳۰ ، و براي تعيين خلوص DNA از طول موج هاي ۲۶۰ و ۲۸۰ استفاده مي گردد. DNA ، در طول موج ۲۶۰ نانومتر جذب بهتري دارد ]۴۲[. در اين پژوهش براي بررسي کيفيت و کميت DNA استخراج شده، از روش Nanodrop استفاده گرديده است.

مطلب مشابه :  پایان نامه درموردعرضه و تقاضا، اوقات فراغت، عزت نفس

۳-۳-۳-۱- تعيين غلظت DNA با روش Nanodrop
تعيين غلظت نمونه هاي DNA توسط UV اسپکتروفتومتر دو بيمي در طول موج هاي ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر انجام مي پذيرد. بدين صورت که با تقسيم طول موج ۲۶۰ بر طول موج ۲۸۰ ، طبق فرمول زير محاسبه مي گردد:
۱OD = 50 µg/ml dsDNA
OD 260/280 ≥ ۱٫۸

عدد به دست آمده بايد بالاتر از ۸/۱ باشد. چنانچه اين عدد پايين تر از اين مقدار باشد نشان دهنده وجود ناخالصي هاي پروتئيني در نمونه مي باشد ]۲۹ و ۴۲[.
بدين منظور ابتدا يک ميکروليتر نمونه DNA را در جايگاه قرارگيري DNA گذاشته و غلظت آن توسط دستگاه محاسبه و خوانده شد، اين عدد همان طور که ذکر شد بايد در بهترين حالت ۸/۱ باشد تا صحت کار تأييد گردد. براي مثا
ل OD يک نمونه از خون هاي استخراج شده حدود ۸۶/۱ مي باشد و غلظت DNA محاسبه شده آن µg/ml93 به دست آمد که نشان دهنده عدم وجود ناخالصي مي باشد.

۳-۳-۴- واکنش زنجيره اي پليمراز ( PCR )
واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR)، يک روش تکثير DNA در خارج از محيط زنده، نخستين بار در اواسط دهه ۱۹۸۰ گزارش گرديد. PCR به دليل ساده بودن، نوعي تکنيک رايج با گستره وسيعي از کاربردهاي متفاوت محسوب مي گردد که اساساً داراي ۳ مزيت عمده: سرعت بالا، حساسيت زياد و قدرت مي باشد ]۱[.
حساسيت اين روش، تکثير مقادير جزيي از DNA هدف را ميسر مي سازد. قدرتمند بودن روش PCR نيز بدين معني است که اغلب، تکثير DNA موجود در سلول هاي به شدت تخريب شده در محيطي که جداسازي DNA از طريق روش هاي استاندارد را دشوار مي سازد با استفاده از PCR امکان پذير مي باشد ]۱[.
اساس روش PCR، شامل سنتز انواعي از توالي هاي اليگو نوکلئوتيدي است که به عنوان پرايمر جهت سنتز DNA جديد در توالي هاي هدف معين موجود در DNA آغازين عمل مي کنند. يعني تکثير انتخابي توالي هاي هدف است. PCR، شامل مجموعه اي از چرخه هاي متشکل از سه واکنش متوالي بوده که در دماهاي متفاوت انجام مي پذيرد ]۲۱[. مراحل پايه اي و تکراري PCR به ترتيب شامل موارد زير مي باشند :
۱- واسرشت شدن ( Denaturation ) : مخلوط تا دماي ۹۴ درجه سانتي گراد گرم مي شود. در اين دما پيوندهاي هيدروژني بين جفت نوکلئوتيدها که مولکول دو رشته اي DNA را بهم متصل نگه داشته، شکسته شده و در نتيجه مولکول واسرشته مي گردد.
۲- اتصال پرايمرها ( Annealing ) : در اين مرحله دماي مخلوط تا دماي ۵۶ -۵۰ درجه سانتي گراد پايين مي آيد. در اين مرحله امکان اتصال ۲ رشته مولکول DNA بهم وجود دارد، اما به دليل وجود تعداد زيادي از اليگونوکلئوتيدهايي با توالي کوتاه، به نام “پرايمر” امکان اتصال دو رشته DNAاغلب امکان پذير نيست و پرايمرها از طريق رابطه مکملي به مکان هاي خاصي از DNA متصل مي شوند.
۳- تکثير DNA جديد (or Extension Synthesis ): در مرحله سوم دما مجددا افزايش مي يابد، البته تا ۷۴ درجه سانتي گراد. اين دما براي فعاليت تگ DNA پليمرازهاي (Taq DNA Polymerase) موجود در مخلوط مناسب مي باشد، تا بتوانند به انتهاي پرايمرها متصل و سنتز DNA جديد را از طريق ايجاد رابطه مکملي باDNA الگو آغاز نمايند.
در پايان اين مرحله, ۴ رشته DNA به دست مي آيد و مجددا دما به ۹۴ درجه سانتي گراد افزايش مي يابد و اين مراحل همان طور که در شکل ۳-۱ نشان داده شده است به صورت تکراري ادامه دارد تا رشته هاي بيشتري سنتز و توليد شوند ]۲۱[.

شکل۳-۱- مراحل PCR

۳-۳-۴-۱- طراحي پرايمر
پرايمرها کليد موفقيت يا عدم موفقيت در فرايند PCR هستند. اگر به درستي طراحي شوند، مي توانند به موقعيت اختصاصي تعريف شده، متصل شوند و توليد DNA هدف را با صحت و دقت، امکان پذير سازند. “پرايمر” يک رشته و توالي کوچکي از اسيدهاي نوکلئيک است که به عنوان آغازگري براي سنتزDNA طراحي مي گردد. از آنجايي که DNA دو رشته اي است دو پرايمر نياز است که در دو انتهاي ژن هدف قرار گرفته شود و از ناحيه ‘ ۳ آن تکثير DNAآغاز مي گردد (شکل ۳-۲). يک پرايمر بايد با رشته الگوي خود در محل اتصال، مکمل باشد تا طبق رابطه مکملي بازهاي آلي، هيبريداسيون اتفاق بيافتد، به طوري که انتهاي ‘۳ پرايمرها، به طرف يکديگر قرارگيرند.

شکل ۳-۲- يک جفت پرايمر طراحي شده در ۲ انتهاي ژن

اولين و مهم ترين نکته اي که در طراحي هر پرايمر بايد بدان توجه داشت، اندازه ي قطعه پرايمر است. اگر قطعه طراحي شده خيلي کوچک باشد، اختصاصيت اتصال آن به DNA هدف کاهش مي يابد و ممکن است به هرقسمتي که تقريباً مکمل باشد متصل شود و اگر بيش از حد بزرگ باشد سرعت PCR را کاهش مي دهد. از آنجايي که کارايي فرايند PCR با توجه به تعداد تکثيرهايي که در زمان تعيين شده توليد مي کند، محاسبه مي گردد، پس قطعه طويل پرايمر اين سرعت را کاهش و کارايي PCR را پايين مي آورد. بنابراين بهترين اندازه براي پرايمر، ۲۰ تا ۳۰ نوکلئوتيد مي باشد ]۲۱ و ۲۲[.
در اين مطالعه ابتدا توالي مربوط به ژن ADRβ۲ از پايگاه اطلاعاتي NCBIN دريافت شد. پرايمرهاي ژن مربوطه که تنها حاوي ۱ اگزون مي باشد با استفاده از نرم افزار PrePrimer و Primer3 طراحي شد که حاوي ۱۹ نوکلئوتيد است. اين نرم افزارها پرايمر را از نظر تشکيل پرايمر- دايمر يا خود مکملي بررسي کرده و مناسب ترين توالي را در اختيار کاربر قرار مي دهد. سپس پرايمرها توسط شرکت “دانا ژن پژوه” ساخته شد. پرايمرهاي استفاده شده در جدول زير آورده شده است.
جدول ۳-۲- توالي پرايمرهاي مورد استفاده براي PCR
نام اگزون
اندازه قطعه
نوع پرايمر
توالي پرايمر ( ‘۳ ‹— ‘۵ )
E1
759 bp
Forward
AAGCGGCTTCTTCAGAGCA

مطلب مشابه :  پایان نامه رایگان درباره...، ضريب، ويريال، 30°،

Reverse
GATGGCTTCCTGGTGGGTG

۳-۳-۴-۲- نحوه انجام PCR
در اين پژوهش، براي تکثير نواحي مورد نظر، واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR) با استفاده از دستگاه PalmCycler CORBETT (ساخت کشور استراليا)، در حجم µl 25 انجام گرفت. مخلوط واکنش شامل : µl 14 آب دوبار تقطير، µl 1 پرايمر R (Reverse) ، µl1 پرايمر F (Forward)، µl2 نمونه DNA استخراج شده از خون بيمار و µl 7 مسترميکس (حاويDNA پليمراز و دئوکسي نوکلئوتيدهاي لازم براي سنتز DNA) (شکل۳-۳).
ويال مستر ميکس (Master Mix) تهيه شده از شرکت “بيوتک پيشگام” حاوي مواد زير مي باشد:
۱- Tris-HCL pH 8.5, (NH4)2SO4 , 3mM MgCl2 , 0.2% Tween 20
2- 0.4 mM dNTPs
3- 0.2 unit/ µl Ampiliqon Taq DNA Polymerase
4- Inert Red dye and Stabilizer

شکل ۳-۳- مواد موجود در ميکروتيوپ PCR

پس از مخلوط کردن مواد فوق، ميکروتيوپ حاوي مخلوط را داخل دستگاه PCR قرار داده و برنامه دمايي متن
اسب با کار تنظيم مي گردد. براي يافتن دماي مورد نظر، گراديان گرفته و دماي ۶۱ درجه سانتي گراد انتخاب مي شود، زيرا در اين دما باند DNA خوب و اختصاصي مشاهده شد. برنامه دمايي تنظيم شده، در جدول ۳-۵ آورده شده است. مدت زمان انجام PCR در اين پژوهش ۱ساعت و ۴۲ دقيقه مي باشد.

جدول ۳-۳- برنامه دمايي دستگاه PCR
Extention
Anealing
Denaturation
Cycle
Segment


Min 5 / ˚۹۵
۱
۱
Sec 30 / ˚۷۲
Sec 30 / ˚۶۱
Sec 30 / ˚۹۵
۳۴
۲
Min 5 / ˚۷۲


۱
۳

۳-۳-۵- الکتروفورز محصولات PCR
يکي از ساده ترين روش هاي تأييد محصولات PCR، الکتروفورز مي باشد. “الکتروفورز” (Electrophoresis) به حرکات ذرات، در يک محيط مايع يا نيمه جامد، تحت ميدان الکتريکي گويند. به سبب اين که ماکرو مولکول هاي زيستي مانند DNA و پروتئين ها، باردار هستند مي‌توان با قرار دادن آن ها در يک ميدان الکتريکي، آن ها را بر اساس خواص فيزيکي مانند شکل فضايي، وزن مولکولي و بار الکتريکي، تفکيک کرد. براي اين منظور از روشي به نام الکتروفورز استفاده مي‌شود ]۲۱[.
مطالعه الکتروفورز DNA در سال ۱۹۶۴، زماني که ۳ گروه از محققان حرکت در محلول آزاد را با استفاده از روش هاي محدود و مرزي اندازه گيري کردند، آغاز شد. آن ها دريافتند که حرکت براي مولکول هاي DNA بزرگتر از ۴۰۰ جفت باز، مستقل از اندازه بود. در حدود همان زمان، با الهام گرفتن از روش جدايي پروتئين ها در ماتريکس ژل مصنوعي، محققان ديگر، شروع به استفاده از ماتريکس هاي مشابه براي جداسازي مولکول هايDNA و RNA براساس جرم مولکولي نمودند. ماتريکس جدايي شامل: پلي آکريل آميد، آگاروز، آگار و ترکيب ژل هاي آگاروز- آکريل آميد مي باشد ]۴۵[.
در الکتروفورز ژل، از يک محيط نيمه جامد به عنوان فاز ثابت استفاده مي‌شود. اين نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلي ‌آکريل آميد (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسيم مي‌شود. مولکول هايDNA در يک ميدان الکتريکي از سمت کاتد (منفي) به سمت آند (مثبت) حرکت مي نمايند. قطعات بزرگتر، کندتر و قطعات کوچکتر، به سرعت حرکت مي کنند. بنابراين در اين ژل‌ها، مولکول‌هاي کوچک‌تر در مقايسه با مولکول‌هاي بزرگ‌تر سريعتر حرکت کرده و مسافت بيشتري را طي مي‌کنند ]۳ و ۲۱[.

۳-۳-۵-۱- ژل آگاروز
ژل آگاروز، يک پليمر متناوبي از ترکيبات “β-D گالاکتوز” و “انيدرو α- L گالاکتوز” مي باشد. مولکول هاي آگاروز در حالت محلول، يک ساختار سيم پيچ تصادفي را در دماهاي بالا ايجاد مي کنند. پس از سرد شدن محلول، زنجيره هاي آگاروز دسته هاي فيبري مارپيچي را تشکيل مي دهند که توسط پيوند هاي هيدروژني به يکديگر متصل شده اند ]۴۵[.
براي تفکيک اسيدهاي نوکلئيک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده مي‌شود.